2022 年，中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）继续坚持“检验依托科研、科研提升检验”战略，始终把科研作为检验检测技术发展进步的第一推动力，全院的科研工作取得了新成效。

　　近日，《中国食品药品检定研究院2022年度科技报告》发布，全面总结和展示了中检院2022年度科技工作成效，供食品药品监督、检验人员和研究人员交流和参考。今日本版摘登该报告中部分项目的研究进展情况及成果介绍，以飨读者。

　　考核指标：运用模式生物斑马鱼模型对制何首乌进行毒性评价；对何首乌中二蒽酮成分群，进行斑马鱼毒性评价；基于二蒽酮类成分进行制何首乌炮制工艺研究，进而建立制何首乌炮制减毒的质量控制方法。

　　以何首乌及制何首乌70%乙醇提取物的末为样品，以模式生物斑马鱼为评价模型，进行斑马鱼胚胎毒性评价。每个样品重复3次，分别于给药后24小时（h）、48h观察斑马鱼的发育变化，包括发育停滞、心包囊肿、脊柱弯曲等畸形状况，并统计各实验组斑马鱼的死亡率。

　　结果显示，随着炮制时间的延长，制何首乌醇提物毒性总体呈下降趋势，其中炮制24h以后，制何首乌样品的毒性最低，LC50值（半数致死量）为170.2mg/L；然后随着炮制时间的延长，毒性略有回升后再下降；到炮制48h以后，制何首乌样品毒性的LC50值为142.8mg/L。

　　最大非致死浓度：何首乌二蒽酮类成分群对斑马鱼的毒性评价采用SPSS26.0软件，利用“浓度-死亡率”拟合最佳效应曲线，计算得到最大非致死浓度值（MNLC）=2.20μg/ mL，95%置信区间范围为0.97~2.84μg/mL，结合实际实验结果，在2.50μg/mL（2.502.20）浓度条件下斑马鱼未出现死亡，故实验采用2.50μg/mL作为MNLC。

　　肝脏组织病理切片分析：正常对照组和溶剂对照组［0.01%二甲基亚砜（DMSO）］，斑马鱼肝脏组织细胞轮廓清晰，细胞质分布均匀，无肿大或空泡，细胞核大小形态规则，相互交错。何首乌二蒽酮类成分群2.50μg/mL浓度组，肝脏组织可见明显空泡样化及细胞排列不规则现象，细胞核固缩，但无明显炎性浸润。结果提示何首乌二蒽酮类成分群可诱发肝脏毒性。

　　肝毒性生化指标评价：在本实验条件下，何首乌二蒽酮类成分群可降低肝脏GSH（谷胱甘肽）含量和SOD（超氧化物歧化酶）活力，同时升高MDA（丙二醛）含量、ALT（谷丙转氨酶）和AST（谷草转氨酶）活力。

　　综上，通过肝脏损伤生化指标GSH、MDA含量和SOD、ALT、AST活力检测，发现与正常组相比，给药组 MDA、ALT、AST水平显著升高；SOD活力、GSH含量显著下降。结果表明，何首乌中二蒽酮成分给药浓度为2.50μg/mL，7天给药后，斑马鱼出现了肝损伤现象，提示何首乌中二蒽酮类成分具有一定的肝毒性。

　　在56批不同产区何首乌中，6个游离二蒽酮总量为0.2084μg/g~380.3744μg/g，差异较大，可达三个数量级。安徽亳州产区何首乌样品中总游离二蒽酮含量最低，为0.2084μg/g；广东高州产区何首乌样品中总游离二蒽酮含量最高，为380.3744μg/g。

　　在30批广东德庆不同生长年限何首乌中，6个游离二蒽酮总量为0.2084μg/g~380.3744μg/g。以相同生长年限不同批次含量测定的平均值进行比较，发现随着生长年限的增加，何首乌中总游离二蒽酮含量呈现下降趋势，说明何首乌以3年以上入药，有其合理性。

　　对不同炮制工艺的制何首乌中总游离二蒽酮进行含量分析，结果显示，四种工艺中总游离二蒽酮含量随着炮制时间延长呈下降趋势。对比四种工艺，以总游离二蒽酮含量作为指标，九蒸九制工艺产品含量最低，炮制工艺最佳。

　　综上所述，何首乌和部分制何首乌样品中均能检出二蒽酮类成分，由此可初步推得何首乌和炮制不合理的制何首乌都存在诱发肝损伤的风险。因此，需要在《中华人民共和国药典》（2020年版）制何首乌质量控制标准项下，建立二蒽酮类成分的限量检查项。

　　发表论文20篇， 其中6篇被SCI收录；申请专利2项，包括“一种何首乌中6种二蒽酮类化合物的检测方法”和“二蒽酮类化合物在制备预防和/或治疗心肌缺血性疾病及其相关病症的药物中的应用”，后者已获授权。

　　实时追踪SARS-CoV-2变异和新发现的SARSCoV-2相关冠状病毒情况，构建相应的假病毒，该项工作在每一年度实时进行，不断扩充假病毒库。

　　在不同种属细胞、不同受体表达细胞和不同蛋白酶受体细胞中研究不同假病毒感染性差异，初步评价跨种属传播风险。

　　通过比较不同S蛋白表达、转运、诱导融合能力，及假病毒表面S蛋白表达水平和S1/S2比例等，初步确定S蛋白变异对感染性影响的机制。

　　由于所有B.1.617变异株都携带P681R突变，与蛋白水解位点相邻，因此研究了蛋白酶过表达（使用多种蛋白酶）对病毒感染性的影响。在B.1.617变异株中，弗林酶过表达增加的感染性略大于D614G参考株。在TMPRSS2过表达时没有观察到类似的现象。

　　随后，通过检查假病毒颗粒中S1和S2蛋白酶的蛋白水解来研究酶蛋白水解活性。与D614G参考株相比，B.1.617变异株、RBD单突变异株或P681R突变异株的S2比例没有显著增加。

　　为了研究B.1.617变异株的S蛋白和P681R突变是否改变细胞间融合特征，使用了Renilla lucifase（spRL）与绿色荧光蛋白（spGFP）融合的双报告系统。荧光素酶或GFP信号的强度表明宿主细胞融合的程度，在供体细胞和受体细胞混合后1~8小时内监测荧光素酶和荧光信号。使用没有经典弗林（δPRRA）位点的假病毒作为阴性对照。B.1.617变异株感染细胞的荧光信号比D614G参考菌株感染细胞的荧光信号高1.2-2.3倍。基于单个突变的进一步分析表明，P681R单个突变增强了细胞间扩散能力。

　　测试了RBD蛋白免疫马血清的中和活性。针对所有B.1.617变异株以及L452R、T478K和E484Q单突变异株或双突变异株，它们的中和活性显着降低。

　　检测了用其他变异株（例如D614G，B.1.351和B.1.429）免疫的血清的中和活性。全长刺突DNA加假型病毒用于对小鼠进行免疫，产生一系列免疫后血清。对免疫血清的分析表明，通过B.1.351和B.1.429免疫获得的抗血清与D614G参考株相比，免疫原对B.1.617变异株的中和活性没有降低。

　　针对B.1.617变异株及其对应的单氨基酸突变构建了22种假型病毒；系统研究了B.1.617变异株感染性和抗原性变化，以及引起这些变化的原因；包括蛋白酶对变异株感染性的影响、变异对细胞融合的影响以及动物免疫血清的中和特性变化。

　　通过对国内外生物安全样本库的标准化分析，结合不同种类病原体及其媒介生物和宿主动物的信息数据和质量管理的特点，研究制定出规范化的生物安全样本库信息数据标准和质量管理体系标准，实现生物安全样本库信息共享和质量可靠，为生物安全样本库的示范提供信息数据及质量管理支撑。

　　课题组起草了“生物安全样本库信息管理技术规范”，并于2022年7月4日向TC559（全国生物样本标准化技术委员会）提交标准草案和标准立项建议书。鉴于本课题开展的工作与ISO21710的等同采用转化工作相似，经过TC559和TC486（全国科技平台标准化技术委员会）协调，中检院和中国医学科学院医学信息研究所（以下简称信息所）加入到ISO21710国标转化项目研究团队中，共同完成国家标准计划《微生物资源机构数据管理及发布规范》的起草。该国标计划由TC486归口，项目周期为16个月。

　　经过对生物安全样本库信息数据共享平台的总体设计与实现、自由定义和扩展的生物安全样本数据库结构与机制两个方面研究，建立了生物安全样本库信息数据共享平台。本系统功能包括：检索样本、新增样本、编辑样本、查看样本、样本关联、样本审批、样本编码管理、样本文件上传以及个人信息管理、系统账号管理等。

　　根据前期调研内容和国内外主要相关文献，完成了“生物安全样本库质量管理体系文件”，质量管理文件的编写采用质量手册及生物安全手册、程序文件、标准操作规范三层基本构架。

　　建立了“生物安全样本库质量管理体系平台”系统，功能包括：检索文件、新增文件、编辑文件、查看文件、文件关联、文件审批、文件盘点、数据统计以及个人信息管理、系统账号管理等。将“生物安全样本库质量管理体系文件”共计194个文件上传到课题编制的生物安全样本库质量管理文件平台。

　　国家标准计划《微生物资源机构数据管理及发布规范》由TC486归口，中检院、信息所为起草单位。

　　按课题计划完成“生物安全样本库质量管理体系文件”并上传到课题建立的生物安全样本库质量管理文件平台。

　　共申请专利8项，其中发明专利3项，包括“一种基于Web的生物安全样本库质量文件管理方法和系统”“生物样本数据的分析方法、装置、设备及储存介质”以及“生物样本库的数据管理方法、装置及系统”；实用新型专利5项，包括“一种基于人工智能技术的信息采集数据标准系统”“一种生物安全样本库用血浆提取装置”“一种生物安全样本库低温液氮运输样本转运装置”“一种生物安全样本库用细胞储存装置”以及“生物安全样本器皿缓存库”，其中“一种生物安全样本库用血浆提取装置”“一种生物安全样本库用细胞储存装置”两项已授权。

　　申请计算机软件著作权3项，包括“生物安全样本库质量管理平台V1.0”“生物安全样本库信息数据共享平台”“生物安全样本库信息编码管理系统”，均已获授权。

　　开展DNA疫苗构象、纯度等检测方法的优化、方法学验证；初步建立假病毒库；开展黏膜免疫检测方法的探索；扩展假病毒库。

　　一是在新型生物制品的生产中，质粒通常被设计成靶基因的递送载体，可直接用作疫苗或作为基因/细胞治疗的中间产物。质粒DNA以几种拓扑形式存在，例如超螺旋、线性和开放环状。由于超螺旋质粒在转染真核细胞中表现出最高的效率，超螺旋质粒的含量成为质粒质量的重要指标。

　　CGE是分离质粒不同拓扑结构的有效分析方法。确定了CGE的最佳分离和检测条件，提出了一种基于平台的质粒分析方法，并使用不同大小的质粒来验证该方法的可行性。

　　在探测器方面，LIF探测器在灵敏度和分辨率上优于紫外探测器。使用最佳CE条件（10×凝胶缓冲液），可以对不同的质粒大小（5.9/7.8/15.4kb）实现不同拓扑形式和杂质的基线分离。

　　此外，使用6.5kb质粒比较不同的分离技术，如CGELIF、离子交换色谱和琼脂糖凝胶电泳。结果表明，与离子交换成像和琼脂糖凝胶电泳相比，CGE-LIF可以提供更好的分离度和定量精度。CGE-LIF作为一种快速便捷的质粒分离和定量方法，具有高灵敏度、高分辨率和高定量准确度等优点。

　　二是为了确定SARS-CoV-2疫苗株在季节性流感疫苗等变异株出现后是否应更新，比较了 SARS-CoV-2变异株和H3N2流感疫苗株的抗原性变化程度。针对当前8个流行变异株和20个可能的变异株，结合基于Delta变异株的前10个流行RBD突变，分析了Alpha、β和γ变异株的刺突蛋白免疫血清的中和活性，这些变异株是使用假型病毒构建的。

　　同时，还针对所有可能的Delta变体检查了恢复期血清和当前灭活和重组蛋白疫苗诱发血清的中和活性。2011—2019年，还对8种表达HA蛋白的DNA诱发动物血清进行了针对H3N2flu疫苗株的8种假型病毒的测试。结果表明，可能的Delta变异株的抗原性变化大多在4倍以。