MTB抗原鉴定是抗原检测技术的基础和前提,鉴定出具有临床意义的抗原对MTB抗原检测新技术的研发具有重要意义。

　　作者单位：首都医科大学附属北京胸科医院转化医学研究室/北京市结核病肿瘤研究所耐药结核病研究北京市重点实验室,北京 101149

　　结核病是由结核分枝杆菌感染导致的严重的呼吸系统传染病,其传播隐匿,防控难度大。目前的结核病快速发现技术存在一定缺陷,亟需新的诊断技术。抗原检测技术具有适用广泛、操作简便、快速精确的优点,但尚未发现具有良好的稳定检测效果的靶标。另外,即使是针对同一抗原靶标,不同研究的检测效能差异也较大。因此,笔者对不同鉴定方法和实验研究证实的各种临床标本中存在的抗原蛋白的检测状况进行综述,以重新思考结核分枝杆菌抗原在临床标本中实际存在的状态和含量,以及改进抗原发现和鉴定的方法,为结核病抗原诊断技术的发展提供理论参考。

　　2020年,全球约150万例患者死于结核病,其中约21.4万例患者合并HIV感染,结核病仍然是危害人类健康的呼吸系统传染病。2010年,世界卫生组织在一项关于控制结核病的报告中指出,由于各种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)抗原检测试剂盒的敏感度和特异度存在较大差异,且检测效能有限,暂不建议将各种血清学MTB抗原及抗体诊断试剂用于结核病诊断,其在我国结核病诊断的临床工作中也不断被弱化。

　　近年来,虽然痰液或者病灶中直接检出MTB是肺结核诊断的金标准,但涂片镜检的阳性率仅有50%左右,且易受检测人员技术水平的影响,存在一定的漏检率;培养法周期较长,不利于早诊断、早治疗。考虑到MTB抗原成分无论是来源于MTB细胞壁、细胞质,还是分泌蛋白和某些代谢组分,都是MTB在内活动的直接证据,具有区分现症感染和既往感染的能力;且不易受检测人员、实验室环境等影响和结核菌素试验结果的干扰,具有即时检测和床旁检测的潜力,抗原检测在某些角度上优于细菌学直接检查,也优于抗体检测。从检测的便携性、检测成本、检测能力来看,MTB抗原检测值得重新关注和研究,以重新评价MTB抗原检测的应用价值。

　　MTB抗原蛋白分布广泛,可存在于血液、脑脊液、尿液、痰液、穿刺组织和结核肉芽肿中,因此,在这些标本中鉴定出具有临床意义的抗原直接关系到检测结果的准确性和可靠性。笔者将依据标本类型,对各种临床样本中的抗原蛋白的发现过程、鉴定方法及应用前景进行综述,以探讨MTB检测技术的发展过程与积极意义,为MTB抗原检测技术的研发及临床应用提供理论依据。

　　血清是结核病检测最常用的样本之一,目前现行的MTB体外诊断实验诸如γ-干扰素和抗体检测大多需要血清样本。但是,血清样本成分复杂,是蛋白质含量最丰富的体液样本,这为MTB抗原鉴定带来了一定困难。目前,研究者应用高分辨率的凝胶电泳技术或者蛋白滤过技术,仍旧可以从血清样本中鉴定出一些有意义的MTB蛋白抗原。Banerjee等利用TAC分馏和凝胶过滤柱层析技术进行一级抗原分离,再利用快速蛋白质液相色谱法(FPLC)进行二级分离,获得了与肺结核和骨结核患者血清高度反应的组分,即肺结核血清循环抗原组分3C(PTS-G3C)和骨结核血清循环抗原组分3B(BJS-G3B)。这两种组分显示出与MTB体外释放的排泄-分泌抗原41(ES-41)相似的FPLC模式。继而,他们在另一项研究中采用硫酸铵沉淀法制备了循环结核抗原蛋白9(CTA-9),应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和FPLC技术,对MTB体外培养滤液进行逐级洗脱,获得了与CTA-9具有相似抗原活性的高血清反应性ES-20。利用ES-20建立的间接ELISA检测方法,对活动性结核病,特别是淋巴结结核显示出了不错的诊断潜力。Harinath利用间接和夹心法酶联免疫吸附测定(ELISA)进一步验证了ES-31和ES-41抗原对不同类型结核病的诊断效果,发现ES-31抗原对淋巴结结核、结核性脑膜炎(tubercular meningitis,TBM)有更好的诊断效能,而ES-41对腹膜结核、骨和关节结核的诊断效果更好。Attallah等利用55kDa循环结核游离抗原的单克隆抗体(TB-55mAb)在血清、脑脊液、腹腔积液等多种体液标本中鉴定到了分子量为55kDa的循环结核游离抗原,并建立了基于55kDa循环结核游离抗原的dot-ELISA检测方法,结果具有较高的敏感度(88%)和特异度(97%)。除使用单克隆抗体进行抗原捕获外,也有研究利用纯化的多克隆抗体鉴定出血液中存在具有免疫原性的抗原,例如43kDa。综上认为,虽然对血清中MTB抗原蛋白的鉴定有了一定进展,但目前仍缺乏系统发现和鉴定血清中结核抗原的新方法,也没有可用于临床优势抗原的充分证据。

　　肉芽肿是一种由巨噬细胞、粒细胞、淋巴细胞和成纤维细胞组成的动态空间结构,这些免疫细胞会将MTB包裹,形成境界清楚的结节状病灶,一方面限制了MTB感染扩散,另一方面也使其成为结核病慢性进程中的关键成分。一些研究和临床数据表明,结核肉芽肿中的细菌负载和MTB的代谢活性都会随着疾病进程发生变化,这些代谢变化和肉芽肿的包裹则会对抗酸染色效果产生不利影响。Goel和Budhwar利用MTB 38kDa抗原的单克隆抗体对肉芽肿中的MTB进行免疫组织化学染色(IHC),结果显示,在36例临床确诊的肺外结核患者中,使用萋-尼染色,仅有13例为阳性结果,而在IHC组中,所有患者的样本均为阳性结果,并且无假阳性和假阴性结果。Mustafa等比较了MTB感染的肺组织和淋巴结组织中的抗原表达水平,发现肺组织中的大多数MTB的分泌抗原(如MTP32、MTP46、MTP64等)可经IHC染色观察到,这可能是由于肺部形成保护性组织肉芽肿的能力有限,无法有效限制MTB的增殖所致,而在淋巴结中形成了控制细菌增殖的肉芽肿,使得细菌的分泌抗原表达量锐减,但体细胞抗原(如Mce1A、Hsp65、MPT57)的存在也可证明淋巴结结核持续感染的存在;另外,通过IHC方法还确定了15例具有硬化结节和空洞等影像学表现的肺结核患者。而对于细菌学阴性的既往肺结核患者的肺组织肉芽肿病灶,也可以通过病灶内存在的Ag85A和分枝杆菌结合DNA结合蛋白1(MDP1)加以佐证。

　　除了蛋白抗原外,甘露糖基化脂原甘露聚糖(ManLAM)是目前研究较多的MTB抗原,在病变组织中含量丰富。LAM是MTB细胞壁上的重要成分,能够随MTB的增殖代谢不断地释放出来。Zhou等研究证明了LAM存在于病变组织中,并将基于ManLAM适配体的IHC检测技术用于结核病检测,其总体敏感度(86.38%)和特异度(92.86%)均较高。

　　以上研究均说明了组织和肉芽肿中结核蛋白和脂类抗原的发现和鉴定必将促进结核病病理学的进一步发展。但其困难的取样方式制约了相应病理快速诊断技术的发展。

　　痰液标本中找到MTB是诊断结核病的可靠手段,但其阳性率低(50%左右)、易漏检,常需要联合其他检查方法。痰液中的MTB抗原检测本应是一项具有潜力的检查手段,但并未在临床工作中得以有效应用。热休克蛋白(HspX)是MTB的主要抗原,用于稳定细菌的蛋白质和细胞结构、提高细菌的抗宿主免疫能力、逃避宿主的免疫清除,几乎存在于MTB的整个活动期,是活动性结核病公认的生物标志物。Pelaáez等也开发了一种无标记表面等离子共振(SPR)生物传感器,用于HspX的床旁检测。这种基于EG硫醇的生物功能化策略的传感器检测系统,未对信号进行任何放大操作,直接反映了机体内的HspX水平,实现了HspX的纳克级(ng)水平检测。

　　目前,国际市场上已有针对痰液中LAM的ELISA检测试剂盒,这种检测试剂盒仍是基于单克隆抗体研发的,在关于其检测效果的两项队列研究中,均发现痰液样本中LAM的定量检测结果与菌落形成单位(CFU)计数存在正相关,能够在治疗前有效地衡量机体内的MTB细菌负荷。另外,由于肺部MTB分泌抗原蛋白的高表达,一些研究针对MTB分泌蛋白MPT64作为靶抗原进行检测,提示其对小儿肺外结核(EPTB)和结核分枝杆菌复合群(MTBC)展现出良好的诊断能力。一些公司还推出了一系列针对痰液培养物中MPT64的抗原诊断产品,但绝大部分还未上市。值得一提的是,痰液样本的处理对痰液标本的抗原检测是个考验,目前广泛使用的以碱处理为代表的蛋白变性等液化方法可能会导致抗原被稀释和某些重要抗原表位的丢失。

　　脑脊液标本获取困难,采集过程中患者需承受巨大痛苦,仅用于诊断TBM。MTB侵入中枢神经系统造成的脑损伤和神经炎症是TBM的始动环节,患者常表现为颅内压异常增高,出现脑膜刺激征,在其发生发展过程中,会引发脑膜炎症,病灶部位出现炎性细胞,如中性粒细胞、浆细胞、单核细胞的趋化和浸润,产生混合细胞反应。Song等使用免疫组织化学方法比较了急性起病的TBM患者第1～4周脑脊液单核细胞的MTB早期分泌性靶抗原6(ESAT6)的抗原表达情况,发现TBM患者在急性起病后的第1周和第2周的阳性率均明显高于对照组,且与第4周的阳性率也有明显差异,这表明EAST6是TBM患者早期诊断的有效抗原。在TBM患者中发现的另一个循环游离抗原是30kDa蛋白,经过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)解离扫描,对产生最大相对丰度的成分进行鉴定分析,证实30kDa条带的衍生肽存在的Ag85A和Ag85B两个蛋白均属于MTB的主要分泌蛋白—Ag85复合群蛋白。有研究表明,Ag85复合群蛋白参与MTB的细胞壁生物合成和免疫原性反应,在MTB的抗宿主免疫中发挥着重要作用。65kDa是一类热休克蛋白,Mudaliar等应用TB-60mAb在TBM患者中检测到65kDa蛋白的存在,并建立了间接ELISA方法用于TBM患者的血清学抗原诊断,显示出84%的敏感度和90%的特异度,但有8%的化脓性脑膜炎患者和10%的病毒性脑膜炎患者出现了假阳性结果,这与Song等的报道一致。脑脊液中检测MTB是TBM的重要检查方法,但临床实践证明,脑脊液直接涂片检测的阳性率较低,而GeneXpert MTB/RIF是检测核酸的常用诊断技术,但存在对TBM检测敏感度有限的缺点。综上所述,直接检测脑脊液中的抗原蛋白是一种确认MTB现症感染的重要诊断手段,在TBM诊断方面具有光明前景。

　　尿液样本容易获取,患者依从性好。尿液中MTB抗原检测的阳性率在免疫缺陷群体中更高,如HIV感染患者,这可能与MTB在免疫缺陷人群中负载量更大,进入尿液中的MTB抗原更多有关。早在2002年,Choudhry和Saxena就对培养滤液蛋白10(CFP10)在尿液标本中诊断结核病的应用价值进行了评估,他们使用纯化的CFP抗体进行夹心法ELISA检测,发现75%的样本为阳性。近年来,Seifert等采用一种高敏感度的原型生物电子结核抗原(BETA)检测技术进行初诊结核病患者的血清和尿液样本中的CFP10的床旁检测,均显示出较好的诊断价值;另外,值得注意的是,该研究显示尿液中CFP10的含量可能要比血清更高,提示当以CFP10为靶标时,尿液样本也许是更好的选择。

　　另一个被确定出现在尿液中的经典MTB抗原是LAM,由Hamasur等首先报道,他们将H37Rv的细胞壁超声产物注射到小鼠腹腔,17h后收集尿液进行夹心法ELISA分析,证实了尿液中有LAM存在。Dahiya等认为尿液中的LAM和CFP10的一种存在形式是细胞外囊泡(EVs),通过EVs这种独特的形式,将结核抗原组分包裹于脂质双分子层中,以参与细胞间物质运输与代谢。他们利用免疫聚合酶链式反应(I-PCR)对尿液中的LAM和CFP10进行检测,结果显示I-PCR的检测限低于ELISA方法106。