本研究结果表明，液体培养具有较高的敏感度，这与既往研究不相符，可能是因为本研究纳入病例样本以肺泡灌洗液为主，且与我院为结核病专科医院，液体培养检验手段熟练及经验丰富有关。

　　作者单位：1浙江中医药大学第二临床医学院，杭州 310053；2浙江大学医学院附属杭州市胸科医院结核病诊疗中心，杭州 310003

　　方法:回顾性搜集2020年1月至2022年2月浙江大学医学院附属杭州市胸科医院结核病诊疗中心收治的123例疑似NTM-PD患者的资料。根据诊断标准，123例疑似NTM-PD患者最终诊断为NTM-PD患者(NTM-PD组；74例)和非NTM-PD患者(非NTM-PD组；49例)。123例患者肺泡灌洗液、痰液、肺组织同时进行mNGS、PCR荧光探针法、BACTEC MGIT 960分枝杆菌全自动快速液体培养(简称“液体培养”)，比较3种方法的诊断效能。

　　结论:在NTM-PD的诊断中，mNGS检测的敏感度较高，可直接鉴定至菌种水平，但特异度较低，应重点提高检测特异度，以更好地服务于临床工作。

　　非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除结核分枝杆菌复合群及麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌的总称。随着我国对结核病的诊断与治疗逐渐完善，临床工作中非结核分枝杆菌肺病(nontuberculous mycobacteria pulmonary disease，NTM-PD)发病率显著上升，且两者无论在临床表现上还是影像学表现上都极为相似，临床诊治中鉴别诊断困难，极易被误诊为肺结核而耽误诊治，但两者临床治疗方案有所不同，NTM对常规抗结核药物存在较高的耐药率，常规抗结核治疗甚至会诱导NTM耐药菌株的产生。因此，提高NTM-PD的临床诊断水平非常重要。

　　宏基因二代测序技术(metagenomic next generation sequencing，mNGS)是近年来新兴的分子生物学诊断技术，mNGS技术可对特定标本中的所有核酸序列进行无偏倚检测，且检测结果较少受到抗菌药物的影响，具有较高的敏感度。目前采用mNGS针对NTM检测的相关研究较少，本研究回顾性分析本院疑似NTM-PD患者的mNGS检测结果，以评估mNGS对NTM-PD的诊断价值。

　　回顾性搜集2020年1月1日至2022年2月28日浙江大学医学院附属杭州市胸科医院结核病诊疗中心收治的123例疑似NTM-PD患者的资料。

　　1.NTM-PD诊断标准：具有呼吸系统症状和(或)全身性症状，经影像学检查发现空洞性阴影、多灶性支气管扩张及多发性小结节病变等，已排除其他肺部疾病，在确保标本无外源性污染的前提下，符合以下条件之一者可诊断为NTM-PD:(1)2份分开送检的痰标本，NTM培养阳性并鉴定为同一致病菌和(或)2次NTM分子生物学检测均为同一致病菌;(2)支气管冲洗液或支气管肺泡灌洗液NTM培养阳性和(或)分子生物学检测1次阳性;(3)经支气管镜或其他途径肺活组织检查发现组织病理学特征性改变(肉芽肿性炎症或抗酸杆菌染色阳性)，并且NTM培养和(或)分子生物学检测阳性;(4)经支气管镜或其他途径肺活组织检查发现组织病理学特征性改变(肉芽肿性炎症或抗酸杆菌染色阳性)，并且1次及以上的痰标本、支气管冲洗液或支气管肺泡灌洗液中NTM培养和(或)分子生物学检测阳性。

　　2.纳入标准：(1)临床特征疑似NTM-PD:具有呼吸道症状和(或)全身症状，影像学表现发现空洞性阴影、多灶性支气管扩张及多发性小结节改变等。(2)获取患者肺泡灌洗液、痰液或肺组织同时进行mNGS、PCR荧光探针法及分枝杆菌培养等检测。(3)送检标本质量合格。(4)具有完整的临床资料，包括mNGS诊断结果、PCR荧光探针检测结果和分枝杆菌培养结果。

　　3.排除标准：(1)患者拒绝送检或未送检mNGS。(2)送检标本质量不合格。(3)临床资料不完整。

　　分枝杆菌培养采用BACTEC MGIT 960分枝杆菌全自动快速液体培养系统(简称“液体培养”)。液体培养阳性后，吸取菌液应用MPB64抗原检测试剂盒检测是否为NTM。鉴定为NTM的样本，采用基因芯片法(北京博奥晶典生物技术有限公司)进行菌种鉴定。具体操作方法参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》中的操作程序进行。

　　采用博奥晶芯分枝杆菌核酸检测试剂盒，核酸提取参照说明书步骤进行，PCR仪选择扩增程序，同时选择FAM和HEX(或VIX)通道，荧光采集点选择60℃，持续30s，放入待扩增样本中，按照分枝杆菌核酸检测PCR扩增程序进行PCR扩增。样品所在反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的PCR循环数(Ct值)参考值为40，样本扩增曲线判断为阳性;扩增曲线(或无任何值)，判断为阴性。若FAM、HEX均为阳性，可判断为结核分枝杆菌;若FAM通道为阳性、HEX通道为阴性，可判断为结核分枝杆菌;若FAM通道为阴性、HEX通道为阳性，可判断为NTM。

　　1.样本采集：留取呼吸道标本3～5ml，将样本与玻璃珠混合振荡，按照TIANampmirco DNA 试剂盒(DP315，北京天根生化科技有限公司)操作说明书提取DNA。

　　2.构建文库：采用Agilent 2100生物分析仪，经过片段化处理和PCR等获取质控DNA文库浓度，经环化形成单链环结构，经滚环复制形成DNB纳米球(DNA namoball)备用。

　　3.测序：将所得DNB纳米球用Illumina NextSeq CN500测序平台进行高通量测序，结合权威的微生物数据库进行生物信息分析。将测序结果按照病毒、细菌、真菌和寄生虫进行分类排列。

　　采用Excel 2010及SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料呈正态分布时以“x¯±s”描述，组间差异采用t检验进行比较;呈偏态分布时以“M(Q1，Q3)”描述，组间差异采用秩和检验进行比较。计数资料采用“例数”和“百分率(%)”描述，组间差异采用χ2检验进行比较，如理论频数T＜5但≥1，采用连续校正的卡方检验。计算3种检验方式诊断NTM-PD的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率。各方法间的一致性检验采用Kappa检验，其中，Kappa值＜0.4表明一致性较差，0.4≤Kappa值＜0.75表明一致性一般，Kappa值≥0.75表明一致性较好。以P＜0.05为差异有统计学意义。

　　本研究共纳入123例疑似NTM-PD患者，最终诊断为NTM-PD者74例(NTM-PD组)，非NTM-PD者49例(非NTM-PD组;包括肺结核19例，支气管扩张伴感染10例，慢性阻塞性肺疾病10例，社区获得性肺炎6例，间质性肺病4例)。纳入患者中，男性69例(56.1%)，女性54例(43.9%)，平均年龄(58.16±14.02)岁。送检标本中支气管肺泡灌洗液样本106份(86.2%)，痰样本10份(8.1%)，肺穿刺组织样本6份(4.9%)，胸腔积液样本1份(0.8%)。123例患者中，合并支气管扩张29例(23.6%)，合并慢性阻塞性肺疾病20例(16.3%)，有肺结核病史24例(19.5%)，合并实体肿瘤8例(6.5%)，合并自身免疫性疾病7例(5.7%)。见表1。

　　以临床诊断(包括确诊及临床诊断)结果为标准，mNGS、液体培养及PCR荧光探针法对NTM-PD诊断的敏感度分别为83.8%、78.4%、67.6%，特异度分别为65.3%、91.8%、87.8%，诊断一致率分别为76.4%、83.7%、75.6%。mNGS、液体培养及PCR荧光探针法与临床诊断结果一致性一般，Kappa值分别为0.524、0.647、0.521。见表2。

　　注 mNGS为宏基因二代测序技术；液体培养为BACTEC MGIT 960分枝杆菌全自动快速液体培养；NTM-PD：非结核分枝杆菌肺病

　　以液体培养结果为参照标准，mNGS检测的敏感度及特异度分别87.1%和59.0%。PCR荧光探针法检测的敏感度及特异度分别为75.8%和85.2%，诊断一致率分别为73.2%和80.5%。mNGS及PCR荧光探针法与液体培养检测一致性一般，Kappa值分别为0.462和0.587。见表3。

　　74例NTM-PD组患者，经mNGS及液体培养+基因芯片法检测NTM菌株，均为阳性者共52例，mNGS阳性、液体培养+基因芯片法阴性者12例，液体培养+基因芯片法阳性、mNGS阴性者6例，两种方法均阴性者4例。液体培养+基因芯片法共鉴定出5种NTM，其中，胞内分枝杆菌38例、鸟分枝杆菌9例、堪萨斯分枝杆菌6例、龟-脓肿分枝杆菌4例、戈登分枝杆菌1例。mNGS共鉴定出7种NTM，其中，胞内分枝杆菌25例、鸟分枝杆菌18例、堪萨斯分枝杆菌5例、龟-脓肿分枝杆菌10例、副胞内分枝杆菌4例、马萨分枝杆菌1例、蟾蜍分枝杆菌1例。以液体培养+基因芯片法为菌种鉴定标准，mNGS检测的准确率为63.8%(37/58)。见表4。

　　2种检测方法不一致菌株共33例，其中12例经mNGS鉴定为胞内分枝杆菌6例，龟分枝杆菌1例，脓肿分枝杆菌2例，鸟分枝杆菌2例，蟾蜍分枝杆菌1例，但液体培养+基因芯片法检测结果为阴性;6例经液体培养+基因芯片法鉴定为鸟分枝杆菌3例，胞内分枝杆菌3例，但mNGS结果为阴性;11例液体培养+基因芯片法鉴定为胞内分枝杆菌，而mNGS鉴定为鸟分枝杆菌5例，脓肿分枝杆菌3例，副胞内分枝杆菌2例，堪萨斯分枝杆菌1例;2例经液体培养+基因芯片法鉴定为堪萨斯分枝杆菌，mNGS分别鉴定为副胞内分枝杆菌及鸟分枝杆菌；2例经基因芯片法鉴定为偶然分枝杆菌及鸟分枝杆菌，mNGS分别鉴定为副胞内分枝杆菌及马萨分枝杆菌。

　　NTM广泛分布于环境中，土壤甚至必要的生活用水均是其重要的传播途径，且人类是其感染宿主，可对全身各个组织器官致病，其中NTM-PD占NTM感染性疾病的绝大多数，是最常见的NTM病。既往认为，与结核分枝杆菌不同，NTM不会在人与人之间进行传播，但Bryant等证实在肺囊性纤维化患者之间，脓肿分枝杆菌存在人与人之间的传播。目前，国内外多项研究表明，NTM病发病率逐渐升高，但因为它在临床工作中并非法定上报疾病，真正准确的流行病学数据有限。NTM-PD临床表现与肺结核相似，同为痰抗酸杆菌染色阳性，极易误诊，一直困扰着临床工作者。以往NTM病诊断需分枝杆菌培养阳性后方能进一步鉴定明确，但因培养所需时间长，易导致诊断延误。随着分子生物学技术的发展，PCR荧光检测及mNGS也应用到了NTM的检测中，本研究即对3种技术的诊断效能进行了评估。

　　mNGS作为新兴分子生物学检测方法中最重要的一员，已被广泛应用于细菌、真菌、病毒等多种感染性疾病的诊断，在分枝杆菌的诊断中具有举足轻重的地位。2020年NTM-PD诊断与治疗指南首次将分子生物学诊断写入诊断标准中。但是，前期研究表明，mNGS对于结核病及NTM的检出率较低，诊断并不具有明显优势。本研究以此为基础，采用mNGS、液体培养及PCR荧光探针3种方法对样本同时进行检测，结果提示mNGS检测NTM敏感度高，具有一定的临床检测价值。mNGS检测NTM的特异度明显低于液体培养法，这可能与mNGS可无偏倚将送检标本中所有病原体检测出来，即使是微量的外部污染也可以出现在测序数据中有关，这势必会降低其特异度。

　　本研究结果提示的mNGS检测呼吸道样本NTM的低特异度值得临床医师警惕，这是由于部分NTM可在呼吸道定植，同时样本有污染的可能。基于mNGS检测NTM的低特异度，本研究对2020版NTM-PD诊断标准第二条提出质疑，笔者认为1次支气管肺泡灌洗液分子生物学检测(mNGS、PCR荧光检测、基因芯片法等)阳。