关于融合基因和基因扩增的检测技术方法很多，目前主流技术和金标准则是FISH方法，另外也可用一种比较有前途的NanoString方法来检测，相对来说比FISH方法更方便、快捷。

　　荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，用来判断待测序列的缺失、扩增及易位等情况。

　　FISH广泛应用于各领域，尤其是基因和细胞领域，随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。

　　1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（FISH）。尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。

　　1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术。

　　1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。

　　对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-Free Srvival,DFS)，指导用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断，针对CML患者的bcr/abl融合基因诊断等）。

　　利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况。

　　取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g，加入1000ml双蒸水中，用磁力搅拌棒搅拌，使其完全溶解，用滤纸过滤，调pH为5.3，封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。

　　用20×SSC和双蒸水，按1:9的比例稀释，调pH为7.0, 封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。

　　取无水乙醇28ml和34ml，分别与12ml和6ml双蒸水混合，配成70%和85%的酒精，与无水乙醇共同组成70%，85%，100%的系列酒精，封口膜封好，室温保存备用；另配制一上述系列酒精，封口膜封好，-20℃室温保存备用。

　　钾5.59g加入1000ml去离子水中溶解（或Kcl 2.794g溶入500ml去离子水中），备用，4摄氏度低温保存。

　　A：取40mg胃蛋白酶，放入1.5MLEP管中，加1ml去离子水溶解，分装到10个200ul离心管中。 B：次使用时，在考普林瓶中加50ml去离子水，加入500ul1M Hcl，加入一管分装的胃蛋白酶溶液（100ul）。

　　① ：将新鲜收集到的羊水（10ml）细胞1500rpm离心8min。（转速可调至1500至2000范 围内）。

　　② ：去上清，加入5ml0.075M kcl低渗液。混匀，后放入37℃水浴30min。（作用：利用 渗透压差使细胞膜破裂，细胞核吸水膨胀。利于探针的杂交。）

　　③ ：加入2ml固定液预固定，（甲醇：冰乙酸=3:1），混合均匀后1500rpm离心8min。(固 定液中主要利用冰乙酸和甲醇的小分子性，有极强的细胞穿透能力，在瞬间杀死细胞，使细胞固定在低渗后的膨胀状态，保证细胞中需要检测的物质不被破坏。)

　　① ：取出预固定好的羊水标本，1500rpm离心8min。去上清，加适量固定液（10ml的羊水 样本，根据细胞的多少，一般留1ML左右的固定液），

　　② ：吹打混匀后吸取少量细胞固定液滴片（滴片前一定要将细胞吹打散开，滴片时保证细 胞均匀散开，不要太密集，也要保证有足够计数的细胞）。自然晾干，56℃烤片30min。（防止掉片）

　　③ ：将上步所得玻片置于37℃2XSSC溶液中浸泡10min。(洗涤玻片，增加细胞核的通透性， 模拟细胞的生理环境，保证细胞被检测物质的稳定性。)

　　④ ：将玻片置于37℃40ml胃蛋白酶工作液中15min。（消化细胞中的各种蛋白，增加组织 通透性，便于探针杂交）。⑤ ：室温下将玻片于70%、95%乙醇中各脱水2min（梯度脱水）。自然干燥玻片

　　①：室温（暗室）下按探针：缓冲液=2:8的比例配制探针混合物，放入200ul EP管中， 充分混匀，离心1-3S.

　　②：将10ul探针混合物滴于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，用封片胶封片（保证杂交 环境湿润状态。

　　③：准备杂交仪，75℃5min变性，42℃16h杂交过夜。（杂交仪使用前添加去离子水到保湿 材料上。）

　　②：玻片洗涤（暗室环境）。将玻片于48℃2XSSC溶液中震荡1-3S,漂洗8min。DOUBLE。

　　③：于48℃0.1%NP-40/2XSSC中漂洗5min。室温下于70%、95%乙醇中脱水各3min。晾干。（NP-40（乙基苯基聚乙二醇）是一种裂解液，去垢剂，非离子表面活性剂，根据浓度不同，作用不同，可以看作是聚乙二醇(PEG)的衍生物，1%浓度时能很好地消化细胞膜，但对核膜没有影响，作裂解液时是一种温和的裂解液，(相对于阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）而言。)）

　　④：复染：将15ulDAPI加入杂交区（DAPI是一种细胞核染料，能够使细胞核在激发光激 发下发出蓝色荧光），盖上盖玻片，20min后于荧光显微镜下观察。

　　b 杂交温度的选择。在37℃-45℃均可进行，选择42℃是因为37℃时杂交灵敏度高，但太多非特异性杂交。45℃杂交特异性高，但灵敏度降低。选择中间42℃比较适宜。

　　c 在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。所以同样的样本及探针在冬天更应该注意温度的控制，或者适当延长浸泡洗涤及消化时间。

　　d 直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。

　　e 在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。

　　g 用于实验的2 X SSC、.01NP-40/2 X SSC洗液、胃蛋白酶工作液、0.01M Hcl、 固定液、 酸性亚硫酸钠和蛋白酶K工作液不可反复使用。

　　① 用移液器取取2ml血液（抗凝血）（最好24小时内处理）（血液样本根据检测项目的不 同，病灶部位的不同，临床医生抽取患者不同部位的血，如：检测MM：抽取骨髓血，检测CML(慢性粒细胞白血病)，抽取外周血。加入10ml离心管中，加入5mlPBS缓冲液，洗涤，1500rpm离心8min。（在模拟细胞生理环境下对细胞进行洗涤。）

　　② 玻片洗涤（暗室环境）。将玻片于48℃2XSSC溶液中震荡1-3S,漂洗8min。DOUBLE。

　　④ 甩干后自然晾干玻片，向杂交区加入15ulDAPI，盖上大盖玻片，（DAPI是一种细胞核染 料，能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光），盖上盖玻片，20min后于荧光显微镜下观察。

　　② 将组织切片浸泡于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10min。（或置于一瓶二甲苯中脱蜡 20-30min）。随后浸入100%乙醇中5min。（无水乙醇洗涤二甲苯）。

　　④：将切片放入去离子水中90℃孵育30min。（或者：50℃下用30%[w/v] 酸性亚硫酸钠（sodium bisulfite ）处理组织切片20－30分钟。）（去除核酸表面的蛋白质，增加组织的通透性，利于探针的杂交）。

　　⑦：将漂洗完的玻片浸入放有2.5%甲醛的PBS缓冲液中（1ml甲醛加入39ml的PBS缓冲液中）中10min（*此步骤可以省略，不影响信号质量，而且甲醛为高毒性物质。故一般不用。）。

　　⑨：按探针：缓冲液=2:8配探针混合物，将10ul探针混合物滴于玻片杂交区域，加盖小玻片，封片。于杂交仪上82℃变性5min，杂交过夜。

　　二：洗片：①：去掉封片胶和盖玻片，于46℃（46-48℃）水浴2XSSC溶液中5min，Double。

　　⑤ 甩干后自然晾干玻片，向杂交区加入15ulDAPI，盖上大盖玻片，（DAPI是一种细胞核染料，能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光），盖上盖玻片，20min后于荧光显微镜下观察。

　　备注：a 冬季脱蜡时间延长， b 根据切割组织样本的厚度不同，以及样本组织的不同，消化时间适当增减。