近年来，结核病免疫诊断技术的研发取得了巨大进展，特别是在IGRA技术之后，相继出现了基于IP-10检测和IL-2检测的MTB感染诊断新技术，一方面提高了MTB感染的检出率，另一方面在免疫低下等特殊人群中表现出较好的诊断价值。

　　作者单位：首都医科大学附属北京胸科医院/耐药结核病研究北京市重点实验室/北京市结核病肿瘤研究所，北京 101149

　　结核病仍然是全球和我国重点防控的传染病之一。尽管目前已将结核分枝杆菌核酸检测阳性纳入结核病确诊依据之一，但临床仍然存在大量病原学阴性的结核病患者，需要依靠免疫学检测技术进行辅助诊断。结核分枝杆菌入侵宿主后引发的免疫病理反应及抗结核免疫应答反应是开发免疫学检测技术的基础，参与免疫应答不同阶段的各类细胞、细胞因子、趋化因子、抗体等都是潜在的免疫学诊断靶标。近年来，基于这些靶标开发了多项免疫学检测新技术，包括γ-干扰素释放试验、新型结核菌素皮肤试验、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)检测、γ-干扰素/白细胞介素-2(IFN-γ/IL-2)双因子检测等，为结核分枝杆菌感染和结核病的诊断带来了新的希望。此外，尚有一些处在研发过程的新型蛋白标识物、多功能淋巴细胞等也表现出较好的潜在诊断价值。笔者将对已用于临床的免疫学诊断技术的应用现状及优缺点进行综述,并探讨未来可能进入临床应用的标识物和其他潜在靶标。

　　据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估算，全球约1/4的人口感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)。我国是结核病高负担国家之一，MTB感染比例较高，约为20%。WHO呼吁2035年消除结核病需要对结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)进行干预。然而，LTBI的诊断仍缺乏金标准，免疫学检测技术是实现MTB感染诊断的主要方法。此外，结核病的确诊需要依靠病原学实验室检查，但并非所有结核病患者都能够获得病原学诊断依据。据2018年数据统计，我国肺结核患者的病原学阳性率不足40%，肺外结核病原学阳性率更低。根据最新的《肺结核诊断》行业标准，依赖于免疫学检测的MTB感染诊断结果已经成为重要的结核病辅助诊断依据。

　　宿主免疫系统与MTB的相互作用决定了MTB感染机体的结局。MTB入侵宿主后引发的免疫病理反应及抗结核免疫应答反应是开发免疫学诊断技术的基础，参与免疫应答不同阶段(天然免疫和适应性免疫)的各类细胞亚型、细胞因子、趋化因子、抗体等，都是潜在的免疫学诊断靶标。笔者主要对已经应用于临床实践的免疫学诊断技术原理、应用现状，以及处于研发和探索阶段的免疫学诊断技术的预期应用潜力进行简要概述。

　　1. 血清学诊断：血清学诊断是以宿主感染MTB后的体液免疫应答为基础，检测MTB抗原或抗体，主要基于酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫胶体金渗滤法、胶体金免疫层析法、蛋白芯片技术等。由于具有操作简单快速、实验技术要求低、价格低廉等优点，曾经是我国结核病诊断的重要辅助手段。但是，2011年WHO对94项商业化结核病血清学检测试剂盒进行了系统评估，认为血清学检测试剂的敏感度(0%~100%)和特异度(31%~100%)变化巨大，存在大量假阳性或假阴性结果，故不推荐使用。WHO的上述建议直接影响血清学诊断在临床中的应用。血清学诊断不确定性的原因复杂，可能与抗原选择及生产工艺差别有关。

　　目前，有多项研究提示结核抗原检测对于结核病的诊断是有价值的，包括脂阿拉伯甘露聚糖抗原(lipoarabinomannan，LAM)、早期分泌抗原靶蛋白6(early secretory antigentic target 6，ESAT-6)、培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)、Ag85抗原复合物及MPT64抗原等。国际研发的基于LAM抗原的侧向流动型尿液检测，在HIV感染人群中诊断敏感度较高，而且随着CD4+T细胞数量降低，诊断敏感度优势越发明显。WHO根据国际多中心研究数据分别于2015年和2019年制定和修订了关于尿液LAM检测的建议，推荐在HIV感染人群中使用。

　　WHO虽然在2011年否定了当时商业化血清学诊断试剂盒的应用，但并未限制结核新型抗原和新的诊断标识物的研究，当前的临床诊断现状也迫切需要发现新型抗原和分子标识物。通过客观准确的鉴定和评价体系筛选合适的抗原或抗原组合是未来血清学检测发展的方向和关键。

　　2. 皮肤试验：结核菌素皮肤试验(tuberculin test，TST)基于迟发型超敏反应，已沿用上百年。在未出现更先进的免疫学诊断技术前，TST检测是检测MTB感染的重要工具，也是结核病的重要辅助诊断工具。但是，由于传统的结核菌素使用结核菌素纯蛋白衍生物，因此容易与卡介苗或非结核分枝杆菌产生交叉反应，导致特异度低。研究提示，在未接种卡介苗的人群中，TST检测的特异度可以达到97%，但在接种卡介苗的人群中，TST检测的特异度仅为59%，临床应用受限。

　　目前，国内外都在研发新型皮肤反应原。一项在南非开展的临床试验提示，新型C-Tb皮肤试验，使用ESAT-6和CFP-10抗原混合物，在结核病患者中的诊断敏感度(73.9%)与γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)持平(75.1%)，在健康人群中的特异度(99.3%)明显高于传统TST(76.9%)，与IGRA检测持平(100%)。国内也有类似研究，将ESAT-6和CFP-10融合蛋白(EC)作为反应原，替代原来使用的结核菌素纯蛋白衍生物。临床试验提示，EC蛋白在诊断MTB感染中能够排除卡介苗干扰，优于传统TST，与IGRA检测结果有良好的一致性，已获得国内临床应用许可。新型皮肤试验的研发为MTB感染诊断和结核病辅助诊断提供了新的方法。得益于其操作便利性和技术要求低等优点，更适合在结核病基层防控机构推广实施。

　　3. IGRA：IGRA是以宿主感染MTB后的细胞免疫应答为基础，通过检测MTB特异抗原刺激后释放 γ-干扰素(IFN-γ)的特异性淋巴细胞数量(酶联免疫斑点法，ELISPOT)或直接检测IFN-γ水平(酶联免疫吸附法，ELISA)来判断机体是否感染MTB，是目前诊断MTB感染的有效工具，也是诊断结核病的重要辅助工具。IGRA技术于2001年获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，延用至今，期间不断有进口试剂盒的更新换代和各类国产试剂盒的问世。

　　不同国家和地区也对该技术在各类人群中的诊断价值给予了较完善的评估。由于纳入MTB特异抗原ESAT-6和CFP-10，该技术能够排除卡介苗的干扰，对于MTB感染的诊断效果较好。基于IGRA检测获得的全球及我国LTBI率均明显低于TST。该技术在活动性结核病患者中的诊断敏感度优于TST检测，阴性预测值较好，但由于无法与LTBI进行鉴别，在结核病高负担国家中的诊断特异度较低，常用于结核病患者的排除，而非纳入。在结核病低负担国家，该技术的诊断敏感度和特异度均优于TST检测，对于活动性结核病的诊断帮助较大。在结核病发病风险预测方面，尽管IGRA检测的阳性预测值、阴性预测值略高于TST检测，但依然无法准确预测结核病发病。在儿童群体中，荟萃分析提示IGRA检测和TST检测基本一致，并未表现出更好的诊断性能，因此并不推荐以IGRA替代TST用于儿童结核病的辅助诊断。但是，IGRA检测在HIV感染、自身免疫疾病和器官移植人群的诊断敏感度优于TST，临床实践中建议单用IGRA检测或者联用TST检测，优先使用基于ELISPOT方法的检测。

　　IGRA检测主要适用于外周血检测，但也有研究探索了该技术在不同体液中的应用价值，发现基于ELISPOT方法的IGRA检测的诊断性能优于基于ELISA方法的IGRA检测。近年来，有研究提出可应用IGRA检测中结核特异抗原免疫应答与阳性抗原免疫应答的比值(TBAg/PHA ratio)作为鉴别活动性结核病和LTBI的指标，但仍需要基于前瞻性大样本队列对该比值进行进一步评价。在临床实践中，存在一定比例(5%~20%)的确诊结核病患者的IGRA检测结果为阴性，原因比较复杂，包括高龄、HIV感染、免疫抑制状态、疾病进程、外周血淋巴细胞数量低、体质量指数(BMI)和人类白细胞抗原(HLA)分型等，其中外周血淋巴细胞数量低主要影响基于ELISA方法的IGRA检测结果。

　　当前也有一些研究试图通过改变IGRA检测中的特异性抗原，获得更好的诊断性能。最近的一项研究在联用原有ESAT-6和CFP-10基础上，依次加入新抗原Rv3615c和Rv3879c，虽然敏感度较结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)有所提升，但特异度也相应下降，并没有表现出更好的诊断性能。QuantiFERON-TB Gold plus诊断试剂纳入了针对CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫应答的抗原，希望提升诊断敏感度，实现不同感染状态的鉴别诊断。但基于目前对其价值评估的荟萃分析数据，并没有体现出鉴别诊断结核病和LTBI的能力，但其诊断结核病和MTB感染的敏感度略高于其他QuantiFERON-TB诊断试剂。对于改良型IGRA检测的研究，未来可能需要尝试更多的新型抗原。

　　4. 干扰素诱导蛋白-10(interferon gamma-induced protein 10，IP-10)：在活动性结核病早期诊断标识物的研究中，发现结核病患者外周血中存在一种高表达的细胞因子，即IP-10。IP-10主要来源于单核/巨噬细胞和T淋巴细胞，是IFN-γ免疫应答通路中一个高表达的CXC家族趋化因子，与IFN-γ受到同一信号通路的调控。

　　有研究证实，将QuantiFERON-TB Gold试剂盒(IGRA的一种)中的检测靶标替换成IP-10蛋白，也适合于MTB特异性细胞免疫反应检测。荟萃分析提示，靶向IP-10蛋白检测用于诊断结核病的敏感度和特异度可达到86%(95%CI：80%~90%)和88%(95%CI：82%~92%)，对LTBI的诊断敏感度和特异度分别为85%(95%CI：80%~88%)和89%(95%CI：84%~92%)。研究发现，在结核特异抗原刺激后2.5~8h内，IP-10 mRNA的表达量显著上调，上调倍数明显高于IFN-γ，而且能在较长时间内保持稳定的高表达。因此，IP-10 mRNA可能更适合作为MTB特异性细胞免疫反应检测的靶标。

　　目前，国内外关于IP-10 mRNA检测用于MTB感染诊断或结核病辅助诊断的研究有限。国外一项研究平行比较了IGRA检测、IP-10蛋白检测和IP-10 mRNA检测在MTB感染中的诊断价值，发现结核特异抗原刺激后的IP-10 mRNA检测的诊断特异度与IGRA检测和IP-10蛋白检测基本一致，但是敏感度略低于其他两个靶标，这可能与结核抗原刺激时间的选择以及RNA提取方案有关。通常情况下，mRNA转录窗口期较短，较长时间的抗原刺激后可能已进入IP-10蛋白累积阶段，mRNA含量下降。因此，锁定恰当的结核抗原刺激时间，捕获处于高表达状态的mRNA对于提高检测性能至关重要。国内也有研究分析了IP-10 mRNA的检测性能，以结核特异抗原刺激后4h作为检测时间点，IP-10 mRNA检测与IGRA检测在诊断MTB感染中获得了基本一致的敏感度和特异度，在HIV与MTB双重感染者中表现出更高的诊断敏感度和更低的不确定结果获得率。

　　5. IFN-γ/白细胞介素(IL)-2双因子检测：IL-2是重要的Th1类细胞因子之一，既往研究发现，结核抗原刺激外周血淋巴细胞。