感染性疾病是严重威胁人类健康的一类疾病，涉及面非常广，临床上几乎所有专业科室都会面临感染性疾病的挑战，而且随着耐药问题的逐渐加重，如何早期、快速、准确地鉴别出致病微生物，成为感染性疾病有效防治的重要前提。传统感染性疾病诊断方法（培养鉴定药敏，血清学检测等）由于速度慢、覆盖面低已经越来越不能满足临床的需求，早期、快速、准确鉴定出致病的微生物将成为临床对病原诊断的要求，也是检验人面临的新的挑战，这时候NGS凭借其速度快，覆盖面广，迅速在临床微生物领域得到应用[1]，今天和大家一块学习一下最近两年临床上应用比较广泛的病原靶向测序（tNGS）技术。

　　病原靶向测序（tNGS）基于超多重PCR扩增（或靶向捕获）与高通量测序两种技术的结合的新一代测序技术，不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的几十种至几百种已知病原微生物及其毒力和/或耐药基因进行富集，再进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类。能够快速、客观地检测临床样本中较多的病原微生物为临床诊断提供依据。对低浓度的病原微生物的检测，特别是其毒力和/或耐药基因检测尤其具有优势[2-4]。

　　tNGS实验流程基本包括以下四步：1、样本总核酸提取（包括人的核酸，致病菌，定植菌核酸等）；2、富集目标病原体的核酸；3、通过高通量测序平台，获得靶向捕获后核酸的序列信息；4、数据分析。

　　现在市场上常见的tNGS产品大同小异，主要区别在于富集目标病原体核酸所采用的的方法，常见的有两种：

　　1. PCR扩增富集：采用两轮PCR法，第一步PCR是目标序列与基因特异性引物的结合，扩增目标序列；第二步是通过PCR引入带有Index序列的测序通用接头，并对目标序列进行富集，纯化后即可完成检测文库的构建，当然也可以将两步合并为一步，对技术上的要求更加严格。

　　2.靶向富集：常规文库构建后，设计与病原体参考序列互补的小RNA/DNA探针，探针靶向富集使整个基因组被重叠探针所覆盖，杂交反应捕获靶标序列。目前两种方法均存在优缺点，没有哪种方法是十全十美的，因此两种富集方法在市场上均存在[5]。

　　另外在测序流程也存在着两种不同流派，主要是二代测序，但三代测序（纳米孔测序）产品也开始登上舞台，与二代测序相比，纳米孔测序速度更快、对标本通量要求低（无需攒够一批样本再上机，对样本量少的实验室比较友好），测序仪更加小巧便宜等优点，如果测序成本可以进一步降低到二代测序的水平，将比二代测序更有优势。

　　谈到tNGS的优势，主要是和mNGS相比，因为无论tNGS还是mNGS对传统的病原学诊断来说优势都是巨大的，无法相提并论。如果把病原微生物的鉴定比作捕鱼，mNGS更像是拿渔网打鱼，不管什么先捞上来，然后再去数据库里进行比对，由于存在大量宿主核酸，因此去人源基因是一个比较头疼的问题，数据库的搭建和生信分析流程算法的要求比较高。而tNGS更像是钓鱼，拿特异性的饵料去调目标微生物，难点在于“饵料”的设计，对数据库及生信算法要求稍微低点。tNGS和mNGS相比主要由以下优势：

　　由于tNGS无需去人源化，直接对靶向基因进行测序，所需测序数据量较小，相比较而言测序更快，价格更便宜。目前市场上的mNGS通常在大几千块（DNA+RNA），而tNGS价格在2000块左右，甚至有公司的小panel靶向产品价格降到了千元以下，这种价格不仅与mNGS相比有优势，和多重荧光定量PCR相比，价格贵的不多，但能做的微生物种类有相当大的优势。

　　由于tNGS首先用特异性的引物或探针对目标微生物的核酸进行富集再进行测序，因此可以检测出浓度很低病原微生物，检测灵敏度上比mNGS更有优势[6]。

　　mNGS检测获得的常规数据量中特定微生物的序列数一般不足样本总序列数的5%，特异性序列覆盖度通常不到特定微生物基因组的1%，因此几乎不可能用于特定微生物的耐药基因及毒力基因进行突变分析。而tNGS可以通过引物或探针对耐药基因及毒力基因进行富集测序，检测出耐药及毒力[2-4]。

　　tNGS作为最近两年才开始大量应用于临床的一种新技术，已经被临床广泛接受，个人认为可能很快会取代mNGS的地位，毕竟价格便宜，价格是王道。另外还有一个重要因素，无论tNGS还是mNGS目前国内都没有获得NMPA认证的产品，但相比于mNGS几万种微生物的panel来说，tNGS几十种至几百种微生物的panel更容易拿到注册证。去年下半年开始NMPA已经发放了数个NGS类的产品注册证，也许不久的将来，就会有小panel的tNGS获得注册证，为产品入院扫清障碍。