乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺不是维持生命活动的重要器官，因此原位乳腺癌并不致命，但癌细胞随血液或淋巴液播散到全身重要脏器，则可危及生命。美国国立癌症研究所预计2018年美国将新增26万例乳腺癌患者(占新增癌症患者总数的15.3%)，约4万例乳腺癌致死病例(占癌症总死亡人数的6.7%)[1]。虽然中国妇女乳腺癌发病率低于世界平均水平，但增长迅速，自1990年以来其上升速率约为全球平均增长速率的2倍[2]。

　　根据2015年的恶性肿瘤统计数据，乳腺癌发病率已跃居中国女性新发癌症的首位，病死率为第6位[3]，对广大女性身体健康造成了极大的威胁。乳腺癌的早诊断、早发现、早治疗能提高患者的生存率，为了诊断出更早期的乳腺癌患者，并提高诊断的准确性，基因诊断的研究越来越深入，因此，笔者就乳腺癌基因诊断新技术进行综述。

　　乳腺癌是少数几种能通过早期诊断而降低病死率的恶性肿瘤之一。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌患者的5年OS率分别为96.8%、73.7%和46.4%，10年OS率分别为78.7%、64.6%和33.5%[4]。美国Ⅰ期乳腺癌确诊患者占比为62%[1]，而中国仅有20%[5]，仍有大量晚期乳腺癌患者，因确诊太晚而无法接受有效的治疗。

　　因此，防控乳腺癌的关键在于通过早期筛查及时发现乳腺癌患者，从而提高患者的治疗效果和生活质量。但由于早期乳腺癌往往不具备典型的临床症状和体征，且大多数肿块为无痛性，很容易被忽视。目前常用的乳腺癌筛查手段有MRI、乳腺X线检查和超声检查等，这些影像学辅助检查各有优劣，在临床诊断中往往需要联合使用[6,7,8]，增加了患者的诊断费用和时间成本。

　　基因诊断与常规影像学检查相比，具有明显的优势。因为先天遗传因素或者后天环境因素都参与了乳腺癌的发生、发展，其中遗传物质(基因)的改变是引发乳腺癌的关键性因素之一[9]。

　　因此，通过研究并检测患者基因序列的变化，能在出现典型的临床表现之前更早的确诊乳腺癌，提高癌症防治水平。

　　HER-2是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的EGFR家族蛋白。HER-2基因的致癌机制是抑制细胞凋亡，促进细胞增殖；增加肿瘤细胞的侵袭力，提高转移风险；促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。30%以上的人类肿瘤中存在HER-2基因的扩增(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等)，其中20%～30%的原发浸润性乳腺癌存在HER-2基因的扩增[12]。目前，HER-2基因是重要的乳腺癌治疗靶点和预后指标。

　　PI3K信号参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，磷脂酰肌醇激酶-3催化亚基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α，PI3KCA)负责编码PI3K的一个催化亚基。PIK3CA基因突变后可导致激酶活性增强，持续活化下游的蛋白激酶B，从而减少细胞凋亡，导致乳腺上皮细胞和成纤维细胞的增殖和转化[29]，约18%～40%的乳腺癌患者中有PIK3CA基因突变[13]。

　　c-myc基因属于核蛋白类原癌基因。c-myc基因参与细胞凋亡的调节，它可使细胞无限增殖，获得永生化能力，与乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、视网膜母细胞瘤、成骨肉瘤等多种肿瘤的发生、发展都密切相关。约40%的乳腺癌患者有c-myc基因扩增[14]。如果下调乳腺癌细胞系中c-myc基因的表达，则能抑制乳腺癌细胞的增殖[30]。

　　ESR1基因编码ERα。该基因位于6号染色体，由配体结合、DNA结合和转录激活3个结构域组成。ERα属于类固醇激素受体超家族成员，是一种配体依赖性转录因子，可与雌激素特异性地结合。该蛋白定位于细胞核，可与ERβ形成同源二聚体或异源二聚体。ESR1基因突变与乳腺癌转移密切相关，在乳腺癌的发生、治疗和预防中具有重要作用[19]。

　　TP53基因是一种重要的抑癌基因，其编码蛋白TP53不仅可以阻止肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，还可以修复正常DNA的损伤，因而被称为的基因。TP53也是迄今发现的与肿瘤相关性最高的基因，其变异与许多癌症发生有关，包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌、胃癌、结肠癌、食管癌等[31,32]。在乳腺癌患者中，遗传因素导致的TP53突变极少(约占1%)，而体细胞的突变更为常见(约占20%～40%)[20]。

　　BRCA1和BRCA2都属于抑癌基因，分别位于的第17号和第13号染色体上，在参与DNA损伤修复、维持细胞正常生长方面具有重要作用。如果这2个基因发生了突变，那么它们所具有的肿瘤抑制功能和对细胞增殖分化的控制能力就会受到影响，癌变的概率将明显增加[21,22]。已发现的BRCA1/2的突变有数百种之多，并与乳腺癌和卵巢癌，乃至男性乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的发生都密切相关，BRCA1基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%～85%和15%～45%；BRCA2基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%～85%和10%～20%[33]。

　　PALB2基因被认为是继BRCA1/2基因之后的第3个乳腺癌关键基因，携带PALB2突变基因的女性，发生乳腺癌的风险在40岁以下人群中增加7～8倍，在40～60岁人群中增加5～7倍，在60岁以上人群中增加4倍[23]。PALB2基因的编码蛋白是抑癌基因BRCA2向细胞核内转移定位及核内稳定的协同因子，在保持基因组稳定和调节细胞周期过程中起重要作用。当BRCA2发生错义突变时会干扰PALB2蛋白的结合，从而使BRCA2失去DNA修复的能力[34]。

　　大约24%的遗传性乳腺癌或卵巢癌患者的家庭成员中能发现BRCA1/2基因突变，而在同时拥有1例乳腺癌患者和1例卵巢癌患者的家庭中，BRCA1/2基因突变的频率则高达41.6%[35]。但仍有很多其他基因突变可能导致乳腺癌的发生，在乳腺癌筛查中仅检测BRCA1/2基因突变是不够的。从另一方面而言，尽管多个乳腺癌易感基因都已经被鉴定，但是这些基因中的任何1个突变都是罕见且因人而异的，如果用常规方法每次检测1个基因既低效又昂贵，NGS时代的到来为解决这个难题提供了可能。

　　NGS与Sanger测序(即第一代测序)技术都是基于边合成边测序或边连接边测序的原理，但与后者相比，NGS具有通量大、精确度高和信息量丰富等优点，可以在较短时间内对感兴趣的基因进行精确定位，可以对未知的序列进行检测，也可以对某组织在某一时间表达的mRNA进行测序。NGS主要包括全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)、全外显子组测序(whole-exome sequencing, WES)以及目标区域测序(targeted region sequencing，TRS)[36]。以高通量为特点的NGS技术在后基因组时代蓬勃发展，有力地支持了肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)等多个肿瘤基因组项目的实施。

　　目前，NGS已在无创产前筛查、肿瘤基因检测、遗传性疾病诊断、用药指导、复发监测等多个临床领域得到广泛应用[37,38]。以肿瘤的基因检测为例，基于NGS技术，未来的癌症治疗将实现对全外显子组的3 000多个基因进行全信号通路检测，从而可根据导致疾病的潜在分子及相关因子对疾病进行诊断和分类，这也使得同病异治和异病同治的精准医学模式成为可能[39]。以乳腺癌为例，癌症基因组图谱已测定了510个乳腺癌外显子组序列，并将其分为5个内源性亚型：luminal A型、luminal B型、正常乳腺样型、HER-2过表达型和基底细胞样型[40,41]。针对不同分型的乳腺癌可采用不同的治疗方案。

　　随着NGS技术的飞速发展，在普通人群中进行NGS检测的费用不断下降。曾有研究利用NGS对有肿瘤家族史的人群进行肿瘤基因检测，结果显示检测肿瘤细胞中BRCA1/2及TP53基因的特异度和敏感度均高于传统检测方法[42]。由于乳腺癌的发生、发展与多个基因密切相关，基于NGS的遗传性乳腺癌基因集合(gene panel)检测在肿瘤风险预测及早期诊断方面更有价值。

　　Tung等[43]采用NGS技术检测了25种肿瘤易感基因(包含了BRCA1、BRCA2、ATM、BARD1、BRIP1、CDH1、CHEK2、NBN、PALB2、PTEN、STK11、TP53这12种与乳腺癌直接相关的基因)，证实了仅仅基于BRCA1/2的突变分析并不能预测其他乳腺癌/卵巢癌易感基因突变所引发的致癌风险。Kraus等[44]也利用NGS技术同时检测14种已知的乳腺癌/卵巢癌易感基因(BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、PALB2、RAD51C、RAD51D、NBN、CDH1、TP53、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)，入组581例家族性乳腺癌患者，并在其中105例患者(18%)的10种基因中发现了106处有害突变，其中16处有害突变(15%)为首次发现；新发现突变中只有6处突变与BRCA1/2基因相关，新发现的6处PALB2基因有害突变中5处突变都与早发型乳腺癌及家族史呈正相关；此外还发现了89处暂未确定意义的新突变。这些结果都显示了临床肿瘤诊断对综合突变体数据库的需求，NGS能凭借高通量、高精确度的巨大优势，发挥更为关键的作用。

　　随着分子诊断技术的不断发展，分子分型在个体化治疗中的重要性日益提高，但无论是乳腺癌确诊还是分子分型指导下的个体化治疗，均需要采集组织标本。然而肿瘤组织取材具有明显的局限性，比如检测次数受限、不能动态监测肿瘤状况、肿瘤异质性使得活组织检查(简称活检)结果存在偏差、取材欠缺标准等[45]。因此，引入新型液体活检(liquid biopsy)技术，对提高乳腺癌诊疗水平具有重要意义。

　　新一代液体活检相较于传统的组织活检具有操作简便、可重复性好、非侵入性等优势。液体活检的主要检测对象包括肿瘤标志物、HER-2蛋白胞外结构域(extracellular domain, ECD)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)等。肿瘤标志物检测基本已成为常规的临床应用，但特异性有待提高；CTCs和ctDNA检测则是近几年新兴的检测方法[45]。

　　ctDNA存在于外周血中，是肿瘤细胞释放到血浆中的单链或双链DNA，其片段大小一般介于160～180 bp之间，半衰期一般不超过2 h，明显短于蛋白等血液学肿瘤标志物。ctDNA具有片段化、低含量、易降解等特点，但却携带有与肿瘤组织一致的分子遗传信息，比如肿瘤相关单核苷酸变异(single nucleotide variants, SNVs)、拷贝数变化(copy number alterations, CNAs)及结构变异(structural variants, SVs)等，可利用这些特点对乳腺癌患者ctDNA进行鉴定[46]。TP53、PIK3CA和ESR1基因的点突变就是乳腺癌ctDNA中较为常见的突变类型[47]。如能将ctDNA检测与NGS技术有效结合，可为乳腺癌患者诊断提供一种无创、实时的新手段[48]。

　　基于NGS的ctDNA检测方法主要通过选定十几到几十种乳腺癌相关基因，对外周血ctDNA进行测序，根据富集这些相关基因的不同策略又可分为靶向扩增子测序(targeted amplicon sequencing, TAS)与目标序列捕获测序(targeted capture sequencing, TCS)。该技术能检测出新突变位点且检测基因数量不受限制，但也存在检测成本高且技术难度大等缺点，其技术完善尚需时。